还在玩ceRNA机制？反义lncRNA通过稳定动力蛋白复合物促癌 | lncRNA专题

论文标题：The HHIP-AS1 lncRNA promotes tumorigenicity through stabilization of dynein complex 1 in human SHH-driven tumors

刊登日期：2022年07月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：17.694

研究机构：德国海德堡癌症研究中心

文献地址：https://doi.org/10.1038/s41467-022-31574-z

前言

Sonic Hedgehog (SHH) 信号传导在促进肿瘤发生、肿瘤生长和进展中起着关键作用。它在成人的各种常见癌症中异常激活，包括基底细胞癌 (BCC) ，髓母细胞瘤 (MB) 和非典型畸胎瘤/横纹肌瘤 ( ATRT ) 等。MB 包括四个主要子群，分别称为 Wingless (WNT)、SHH 、Group 3和Group 4。

针对 SHH 信号以消除其在 SHH MB 中的有丝分裂作用已在临床前动物模型和人类中显示出疗效。然而，SHH 抑制剂的临床应用，例如 G 蛋白偶联受体平滑 (SMO) 拮抗剂，由于迄今为止在 SHH MB 儿童中出现毒性或耐药性而受到限制。虽然几个蛋白质编码基因的突变和改变表达是 SHH 依赖性肿瘤发生的公认驱动因素，但非蛋白质编码基因组的确切影响在很大程度上仍未探索。特别是，对长链非编码 RNA (lncRNA) 在 SHH 驱动的恶性肿瘤中的特殊作用的研究的研究方面。

近日，德国海德堡癌症研究中心在Nature Communications发表了题为“The HHIP-AS1 lncRNA promotes tumorigenicity through stabilization of dynein complex 1 in human SHH-driven tumors”的研究论文，揭示了一种 lncRNA 介导的机制，该机制能够在人类肿瘤中实现 SHH 通路激活的促有丝分裂作用。

01

Lnc RNA HHIP-AS1的过表达是人SHH 驱动肿瘤的标志

转录组测序分析结果显示，HHIP-AS1在SHH MB 中特异性过表达，作者将其鉴定为 SHH MB 中最特异性过表达的 lncRNA，且这种过表达在ATRT，BCC，横纹肌肉瘤中均存在，且相关性分析显示HHIP-AS1表达量与其甲基化程度呈负相关。

有文献报道称HHIP-AS1与HHIP共享的低甲基化启动子的活跃转录（一种成熟的 SHH 通路调节剂），其基因组定位显示与HHIP-AS1的基因座是头对头方向。

相关性分析显示HHIP和HHIP-AS1表现出高相关性，荧光素酶检测揭示了启动子区域在体外存在正向和反向活性，表明启动子低甲基化可能同样可以驱动HHIP-AS1和HHIP的过表达SHH驱动的肿瘤中的转录本。

02

HHIP-AS1在人类 SHH 驱动的脑肿瘤中的功能是必需的

作者进一步验证了HHIP-AS1表达是否依赖于肿瘤细胞中的SHH信号传导。发现在所有的细胞模型中，使用CYC（SMO 拮抗剂）可以通过抑制 SMO 显着降低 HHIP-AS1的表达；其次GLI1和GLI2的瞬时敲低降低了所有上述 SHH 癌细胞模型中的 HHIP-AS1和HHIP表达，而 GLI1 的过表达导致HHIP和HHIP-AS1的表达增加，这些结果均证实HHIP-AS1是SHH信号传导的靶基因。

为了评估HHIP-AS1的功能影响，作者将HHIP-AS1沉默，发现HHIP-AS1的敲低导致增殖减少，活力下降，克隆形成性降低，此外还发现HHIP-AS1消耗降低了两名 SHH MB 患者原代培养物中的增殖和活力，并损害了 ICN-MB12 培养细胞（SHH MB 患者衍生的异种移植模型）的增殖。

相反的是，HHIP-AS1的过表达恢复了减少的增殖和活力，这表明HHIP-AS1不仅在 SHH 驱动的肿瘤中异常过表达，而且在恶性肿瘤中也具有功能相关性。相反，将HHIP-AS1 siRNA 转染到 HHIP- AS1低表达的非 SHH MB 细胞（HD-MB03 和 CHLA-01）中不会导致增殖和活力降低，排除潜在的脱靶效应并证实HHIP-AS1的功能相关性仅限于 SHH 驱动的肿瘤。值得注意的是，HHIP在稳定的 HHIP-AS1耗尽后，对 mRNA 表达或蛋白质水平没有影响。因此，在后续的 MB 和 ATRT 模型中，作者排除了HHIP-AS1对HHIP的顺式调节作用。

03

HHIP-AS1下游靶标的鉴定和功能验证表明HHIP-AS1与DYNC1I2的 mRNA 结合

为了破译由 HHIP-AS1介导的分子机制，作者进行了转录组及蛋白组的联合分析发现 HSD17B10 和 DYNC1I2受到HHIP-AS1的影响，且将DYNC1I2 和HHIP-AS1共表达发现其与 HHIP-AS1 具有显著性相关性，而SD17B10 没有显着相关性。qRT-PCR 和免疫印迹验证发现HHIP-AS1 缺失降低了3类细胞系中 DYNC1I2 的 mRNA 和蛋白质表达。

作者为了进一步探究 HHIP-AS1 和 DYNC1I2 mRNA 之间的潜在相互作用机制，首先进行了RNA 荧光原位杂交，发现这种共定位可以分别通过 SHH 激活或抑制来增强或破坏。其次，作者使用针对 HHIP-AS1 RNA 的以 RNA-RNA 为中心的下拉探针组证实了在三个细胞模型中，DYNC1I2 mRNA 被特异性富集。最后，使用生物层干涉仪，发现 HHIP-AS1 结合 DYNC1I2 是物理相互作用。且用 HHIP-AS1 结合 DYNC1I2会使其半衰期延长。所有这些发现证实了这两种 RNA 在体内和体外存在功能性和直接的物理相互作用，最终调节 DYNC1I2 的表达水平。

为了阐明 HHIP-AS1 和 DYNC1I2 相互作用是由 HHIP-AS1 介导，作者评估了 DYNC1I2 耗竭在细胞模型中的功能影响。发现瞬时敲低DYNC1I2 导致增殖和活力降低到与 HHIP-AS1 耗尽时观察到的相似程度。当使用基于 CRISPR-Cas9 的激活过表达 DYNC1I2 时，HHIP-AS1增殖和活力都恢复了，表明 HHIP-AS1 通过控制DYNC1I2 在肿瘤细胞中的丰度发挥其促增殖作用。

04

HHIP-AS1和DYNC1I2之间的相互作用促进有丝分裂

细胞质动力蛋白复合物 1 与各种表型有关，包括细胞质微管上的货物运输。最近有报道称， DYNC1I2 的丢失会破坏斑马鱼神经祖细胞中的有丝分裂纺锤体组织。因此，作者假设 HHIP-AS1 缺失可能也会通过降低 DYNC1I2 的可用性在人类肿瘤细胞中引起类似的影响。事实上，作者发现与 siRNA 转染的细胞相比，通过 siRNA 转染瞬时敲低 HHIP-AS1或DYNC1I2可以显着且持续地改变了细胞中的有丝分裂纺锤体组织，导致更多的 DNA损伤。此外，在其他的细胞系中也发现了这种现象。更重要的是，通过基于 CRISPR-Cas9 的激活过表达 DYNC1I2 和 HHIP-AS1，恢复了有丝分裂纺锤体组织，这表明在瞬时 HHIP-AS1 敲低的情况下，HHIP-AS1 通过控制DYNC1I2丰度维持有丝分裂纺锤体的稳定促进增殖。

05

HHIP-AS1阻断内源性 hsa-miR-425-5p 功能以维持 DYNC1I2 水平

为了进一步阐明 HHIP-AS1 可以通过稳定 DYNC1I2 mRNA的表达进而发挥其促增值作用，作者评估了 RNA-RNA 相互作用的基因序列，发现六个潜在 miRNA 结合位点，表明 HHIP-AS1 通过结合 DYNC1I2  miRNA 进行依赖性调节 DYNC1I2 表达。这些候选 miRNA 与 DYNC1I2 的167个原始 MB 样本的 RNA 测序数据进行比对，发现四种未在 MB 患者样本中检测到，而两种 miRNA 在 MB 患者样本中显示表达，即 hsa-miR-425-5p和 hsa-miR-1915。值得注意的是，hsa-miR-425-5p 表达水平在 MB 患者和细胞模型的分子亚组之间没有差异，而与SHH MB四个亚型呈反相关。进一步将数据集划分为 SHH 和非 SHH MB 后，仅在非 SHH MB 样本中保持反相关。

因此作者检测了hsa-miR-425-5p与DYNC1I2之间是否存在功能关系。首先，在荧光素酶结果显示 hsa-miR-425-5p结合DYNC1I2导致荧光素酶表达减少。重要的是，这种效应在 DYNC1I2 5'UTR 上的 miRNA 结合序列发生突变后被消除。其次，作者证明了 HHIP-AS1 敲低，hsa-miR-425-5p抑制显著增加了DYNC1I2 mRNA的表达水平，而转染阴性对照 miRNA 抑制剂并没有恢复 DYNC1I2 表达。在体外转染 sh-HHIP-AS1 仅具有 HHIP-AS1bind 的组使得DYNC1I2 mRNA 更高的表达，与 hsa-miR-425-5p 抑制无关。第三，hsa-miR-425-5p 的抑制恢复了由 HHIP-AS1 敲低而减少的增殖表型。最后，通过阻断 hsa-miR-425-3p 对 DYNC1I2 表达水平没有影响。

06

HHIP-AS1的缺失延长了体内 SHH 驱动的脑肿瘤的生存期

最后，作者评估了靶向HHIP-AS1是否影响体内肿瘤生长。首先作者利用了两个已建立的具有异常SHH信号激活的原位脑肿瘤模型。发现与相应的等基因对照相比，原位植入的Daoy和CHLA-266细胞中HHIP-AS1的稳定敲除显著延长了受体小鼠的生存期。

荧光检测结果表明，HHIP-AS1的丢失影响体内肿瘤的形成。在体外将SHH-Med-1712-FH PDX模型细胞转染sh-HHIP-AS1或对照shRNA，然后移植到受体小鼠的小脑中并进行qRT-PCR证实了HHIP-AS1基因的敲低以及相应的DYCN1I2基因的减少。

有趣的是，注射PDX细胞使得HHIP-AS1的沉默延迟了动物发病迹象的出现，与对照组小鼠相比，动物的平均生存显著延长。且发现与对照肿瘤相比，HHIP-AS1缺失显著降低了Med-1712-FH PDX肿瘤中的细胞增殖指数。且在肿瘤组织中观察到更多的分化细胞，与之前的体外数据一致。作者在Med-1712-FH PDX肿瘤中检测到半胱氨酸蛋白酶活性没有变化。然而，与对照和NSC相比，观察到HHIP-AS1耗尽后肿瘤组织中的DNA损伤更多。

总之，这些结果为HHIP-AS1在体内促进SHH驱动的人类肿瘤的致瘤性提供了令人信服的证据。

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